近期，美国华盛顿大学戴维·贝克（David Baker）教授课题组首次从头计算设计酸碱响应性的蛋白质纤维，并得到高分辨率的结构验证。

通过结构设计，达到了对于酸碱度十分精确的响应和控制：基于微小的酸碱度变化即可实现组装和解聚，而且，酸碱度的阈值还可以通过设计进行控制。

该设计只需在计算设计中选取单体核心结构位点，引入酸碱响应的氨基酸。因此该方式具有普适性，可以广泛产生更多的酸碱响应性材料。

这种从头设计的环境响应性、结构可控的自组装蛋白纤维，有望发展为多种响应生物材料的应用。

例如，响应性水凝胶、环境响应生物材料、针对特定酸碱度环境的药物释放等。

审稿人对该研究评价称：“该研究是理性设计响应性材料的重要突破。作者设计的成功率是显而易见的，可靠的蛋白组装设计，尤其是螺旋纤维是很难的，目前只有该团队能做到。”

近日，相关论文以《pH 响应性自组装螺旋蛋白质纤维的从头设计》（De novo design of pH-responsive self-assembling helical protein filaments）为题发表在 Nature Nanotechnology 上[1]。

华盛顿大学博士后研究员沈浩为第一作者兼共同通讯作者，戴维·贝克（David Baker）教授担任共同通讯作者。

图丨相关论文（来源：Nature Nanotechnology）

自然界进化出很多环境（比如酸碱度 pH）响应性的纳米材料，来实现精确、动态的自组装。

例如，蜘蛛蛋白丝在酸性条件下组装；CTP（胞嘧啶核苷三磷酸，cytidine triphosphate）合成酶在酸性条件下，组装成纤维结构，以维持酵母细胞断食期间的稳态。

细菌内的 R 体蛋白在酸性条件下，通过构象变化组装成长条管状结构来产生动力。这些材料启发很多生物工程师，以设计酸碱度响应性的蛋白材料。

此前的酸碱响应纳米材料，有些是模仿蚕丝蛋白，有些是通过在的肽链堆叠中，引入随酸碱度变化的组氨酸。

但是，从头设计具有精确结构、可调酸碱阈值的酸碱响应性纤维，仍是“未解难题”。

基于此，该团队设想，或许可以设计出一种自组装螺旋蛋白质纤维，而且能通过酸碱度控制单体折叠。

“我们推测，其单体核心由组氨酸构成：组氨酸的质子化状态基于溶液酸碱度的变化。由上千个此种单体组装成的蛋白质纤维，它的酸碱度响应会十分灵敏和协同。”沈浩表示。

该课题组曾设计酸碱响应性的蛋白质三聚体，通过作者此前把单体设计成螺旋纤维的方法，将该单体设计成酸碱响应性的蛋白质自组装纤维[2]。

图丨生成 pH 依赖的蛋白质纤维的设计策略（来源：Nature Nanotechnology）

在该研究中，研究人员首先从计算机设计，得出酸碱适应性的单体的各种螺旋自组装的可能构象。

然后，使用该实验室发展的 Rosetta 计算方法设计蛋白质界面，并将设计的蛋白质序列逆转录成 DNA 序列。

沈浩解释说道：“这样能够让合成的基因在细菌内表达蛋白，通过生物化学的方式纯化蛋白质，进行电子显微镜的结构表征。然后，找出能够形成微米尺度纤维的设计，通过冷冻电子显微镜来解析纤维结构。”

另一方面，该课题组采取了多种方式，对所设计的纤维进行酸碱响应性表征。

具体来说，基于电子显微镜，能看到不同酸碱度下纤维平衡态的长度。然后，研究人员采用荧光显微镜，实时观测纤维在不同酸碱度下的动态组装和解聚。

图丨蛋白质纤维的酸碱度响应表征（来源：Nature Nanotechnology）

为了提高分辨度，他们还采用原子力显微镜，以能够实时精确地观察纤维在不同酸碱度下的结构变化。其中，不同酸碱度阈值的设计和修正结构经过了几次迭代升级。

图丨原子力显微镜下精确的动态结构表征，其中图 e 是用激光激发 photoacid，可以实现界面上精确的光控解聚（来源：Nature Nanotechnology）

在初次冷冻电镜解出的纤维结构（代号 DpHF18）中，研究人员发现，主要的第一设计界面符合计算设计，但是其次的第二界面出现了变化。

图丨设计细丝的冷冻电镜结构表征（来源：Nature Nanotechnology）

为了蛋白纤维的溶解度和计算复杂度，第二界面相对较小。此前，沈浩设计的纤维也有类似符合计算设计第二界面，但这次第二界面却出现了二面对称性。

具体来说，原来 AB 的界面现在是依次 AA、BB 交替。这也是实验科学中常会出现的意外变化，二面对称性也有自己的特性和用途。

由此，沈浩推测道：“这种产生二面对称的纤维我之前没有碰过，可能是因为酸碱度响应的单体本身是来源于三聚体，有自身的对称性。因此，由之产生的堆叠，也有了更多组装成纤维的可能空间构象。”

自组装纤维的螺旋对称性十分复杂，稍作变化就可能会变成不一样的螺旋对称性，或者无法嵌合成为纤维。

第一次碰到这种情况，虽然没有把握，但研究人员还是尝试先通过一些氨基酸的点突变，把第二界面的二面对称性破坏。

成功破坏后，他们再尝试引入一些互补带电的氨基酸，来稳定原来纯螺旋对称性的界面。而后，研究人员惊喜地发现纤维又能长回来。

但是，因为上述单体自身带有对称性，而且低分辨率的纤维都很相似，直到解析出高分辨率冷冻电镜的纤维结构，该团队才确认了“新”的纤维（代号 DpHF19）确实吻合最初计算设计的螺旋对称的所有界面。

由此，两种相似但不相同的纤维，有望能够用于一些对于手性相关的研究。

沈浩解释说道：“因为 DpHF18 的二面对称性，所以它有双向同性的性质（手性互相抵消），而 DpHF19 具有纯螺旋对称性，具有蛋白自带的极性。”

图丨沈浩（来源：沈浩）

沈浩本科毕业于清华大学生物系，之后赴华盛顿大学攻读分子工程学博士学位，师从美国科学院院士、华盛顿大学教授、计算蛋白质设计领域的先驱戴维·贝克（David Baker）。

目前，沈浩在华盛顿大学蛋白质设计中心从事博士后研究。

据了解，该团队在设计自组装螺旋蛋白质纤维时，蛋白界的 AI 还未兴起，因此他们主要用 Rosetta 基于物理能量和统计能量计算方式。

沈浩指出，目前，AI 对于螺旋对称性的预测还不准确，未来会引入 AI 方法到课题的不同方面。

该课题组的下一步计划，是研究纤维在酸碱度响应下组装的材料性质。例如，对溶液黏稠度，以及对生物材料组合产生的物理化学等性质的影响。

此外，还可以使用纤维通过相关制备方法来包裹药物，以实现特定酸碱度下释放。目前，他们还在探索更多的酸碱响应性材料应用，有意者欢迎联系沈浩博士。

参考资料：

1.Shen, H., Lynch, E.M., Akkineni, S. et al. De novo design of pH-responsive self-assembling helical protein filaments. Nature Nanotechnology(2024).https://doi.org/10.1038/s41565-024-01641-1

2.Shen, H.et al. De novo design of self-assembling helical protein filaments. Science(2018). https://www.science.org/doi/10.1126/science.aau3775

排版：刘雅坤

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